过去五十年里，肺癌的发病率和死亡率均显著上升。根据组织病理学特征，肺癌可分为小细胞肺癌（SCLC）和非小细胞肺癌（NSCLC）。肺腺癌（LUAD）是NSCLC中最常见的类型，约占NSCLC的55%。尽管肺癌治疗已取得很大进展，如手术、化疗、放疗和分子靶向治疗等，但流行病学证据显示，肺癌患者的5年生存率仍低至15.9%。在肺癌发生过程中，RNA结合蛋白（RBPs）和环状RNA（circRNAs）发挥着关键的调控作用，其异常表达影响肺癌发生发展，关于其相关作用机制有待进一步解析。
2025年7月8日，温州医科大学王瑜敏教授团队在Molecular Cancer（IF=33.9）上发表了题为《M6A-Methylated circRAPGEF5 drives lung adenocarcinoma progression and metastasis via IGF2BP2/NUP160-mediated autophagy suppression》的研究论文。该研究发现circRAPGEF5在肺腺癌细胞中高表达，且能显著抑制自噬流，同时促进肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭。机制研究表明，circRAPGEF5可直接与IGF2BP2（胰岛素样生长因子2 mRNA结合蛋白2，一种m6A的Reader）的KH3-4功能域相互作用，有助于IGF2BP2介导的核孔复合体组分NUP160 mRNA的稳定性。通过敲低NUP160，能有效恢复自噬活性，从而减弱肺腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭等。体内异种移植模型进一步验证显示，circRAPGEF5/IGF2BP2/NUP160信号轴通过抑制自噬促进肿瘤的生长和转移扩散。总之，该研究揭示了circRAPGEF5可通过IGF2BP2/NUP160介导的自噬抑制来促进肺腺癌转移。
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下面，我们一起来了解具体的研究内容：
研究成果
1.circRAPGEF5抑制肺腺癌细胞的自噬
作者之前的研究表明，circRAPGEF5在肺腺癌患者中表达升高，并通过miRNA-126-3p/ZEB1轴促进肺腺癌的增殖、迁移、侵袭及上皮间质转化（EMT）。在此基础上，作者发现circRAPGEF5与自噬密切相关。敲低circRAPGEF5可增加自噬溶酶体和自噬小体，而过表达circRAPGEF5则使其减少（图1A）。WB分析显示，敲低circRAPGEF5会降低P62的表达并增加LC3-II/I的比值，而过表达circRAPGEF5则产生相反的结果（图1B）。自噬抑制剂3-MA可逆转敲低circRAPGEF5对增殖、迁移、侵袭及克隆形成的抑制作用；而雷帕霉素（RAPA）激活自噬可逆转过表达circRAPGEF5对这些细胞过程的促进作用（图1C-E）。以上结果表明，circRAPGEF5可通过抑制肺腺癌细胞的自噬，从而增强其增殖、迁移、侵袭及集落形成能力。
图1. circRAPGEF5抑制肺腺癌细胞的自噬
2.m⁶A修饰的circRAPGEF5与IGF2BP2蛋白结合，并受m⁶A修饰及IGF2BP2的调控
为阐明circRAPGEF5抑制自噬的分子机制，作者进行了RNA pull down实验，显示circRAPGEF5探针组存在明显的蛋白条带（图2A-B）。质谱和WB分析证明，circRAPGEF5与IGF2BP2存在显著结合（图2C）。同时，RIP实验也证实了IGF2BP2与circRAPGEF5之间的相互作用（图2D-E）。IF和FISH实验表明，IGF2BP2与circRAPGEF5在细胞质中共定位（图2F）。MeRIP发现H1299细胞中整体m⁶A水平高于BEAS-2B细胞（图2G），且在A549和H1299细胞中，circRAPGEF5的甲基化水平高于IgG组（图2H）。RT-qPCR显示，敲低METTL3（甲基转移酶3，一种m6A的Writer）会降低circRAPGEF5的表达水平并减弱IGF2BP2与circRAPGEF5的结合。此外，敲低或过表达IGF2BP2分别会抑制或促进circRAPGEF5的表达（图2I-K）。为确定IGF2BP2与circRAPGEF5的结合位点，RIP实验结果表明，IGF2BP2主要通过KH3-4区域与circRAPGEF5结合（图2L）。敲低circRAPGEF5后，分别转染WT和缺失KH3-4区域的IGF2BP2质粒，KH3-4缺失减弱了对circRAPGEF5的响应（图2M）。这些发现共同表明，circRAPGEF5与IGF2BP2结合，且其表达受m⁶A修饰和IGF2BP2的调控。
图2. circRAPGEF5与IGF2BP2的KH3-4区域结合，且其表达受m⁶A甲基化修饰调控
3.IGF2BP2可以促进肺腺癌的转移和进展，抑制肺腺癌细胞自噬
由于不同肺癌细胞系中IGF2BP2表达存在差异，A549细胞中IGF2BP2表达水平较低，而H1299和HCC827细胞中IGF2BP2表达水平较高，为探究IGF2BP2在肺腺癌中的作用，作者在H1299和HCC827细胞中构建了IGF2BP2敲低细胞系，在A549和HCC827细胞中构建了IGF2BP2过表达细胞系（图3A-C）。敲低IGF2BP2后，H1299和HCC827细胞的增殖、迁移、侵袭和集落形成受到显著抑制（图3D-H）。WB实验表明，在H1299和HCC827细胞中，敲低IGF2BP2会抑制N-cadherin和Vimentin的表达，上调E-cadherin的表达（图3I），而过表达IGF2BP2则与敲低作用相反。
图3. IGF2BP2促进肺腺癌的转移和进展
为探究IGF2BP2与肺腺癌细胞自噬之间的潜在关联，作者对自噬相关蛋白和自噬流水平进行了分析。敲低IGF2BP2会导致P62减少、LC3-II/I比值增加（图4A），并使自噬溶酶体和自噬体的水平升高（图4B）。3-MA可逆转敲低IGF2BP2后对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用，而RAPA则可抑制IGF2BP2过表达后对细胞的增殖、迁移和侵袭的促进作用（图4C-E）。以上实验结果表明，IGF2BP2可以促进肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭和EMT，抑制细胞自噬。
图4. IGF2BP2对肺腺癌细胞自噬的抑制作用
4.IGF2BP2与circRAPGEF5协同促进肺腺癌的转移和进展
为证实circRAPGEF5与IGF2BP2之间的关联，作者构建了circRAPGEF5_OE+IGF2BP2_KD和circRAPGEF5_KD+IGF2BP2_OE的HCC827细胞（OE：过表达；KD：敲低）。CCK-8和EdU实验（图5A-B）、迁移和侵袭实验（图5C）、集落形成实验（图5D）以及WB（图5E）证实，敲低IGF2BP2可逆转circRAPGEF5过表达对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭、集落形成及EMT的促进作用。相反，过表达IGF2BP2可逆转敲低circRAPGEF5对肺腺癌细胞中这些过程的抑制作用。这些结果表明，IGF2BP2与circRAPGEF5可协同促进肺腺癌的转移和进展。
图5. circRAPGEF5与IGF2BP2协同促进肺腺癌进展
5.IGF2BP2与NUP160相互作用并稳定其mRNA，敲低NUP160可诱导肺腺癌细胞自噬
为探究IGF2BP2的靶基因，作者用StarBase数据库（https://starbase.sysu.edu.cn/）预测显示，NUP160可能是IGF2BP2发挥作用的关键因子，且与IGF2BP2呈正相关（图6A）。FISH与IF结果表明，NUP160与circRAPGEF5共定位于细胞质（图6B）。RIP实验显示，IGF2BP2与NUP160存在相互作用（图6C）。NUP160 mRNA在A549细胞中低表达，在H1299和HCC827细胞中高表达（图6D），作者对H1299和HCC827细胞进行敲低发现，sh1-NUP160靶点效果较好（图6E）。且敲低NUP160可抑制肺腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭、EMT及集落形成能力（图6F-J）。放线菌素D实验显示，IGF2BP2具有稳定NUP160 mRNA的作用（图6K）。
图6. NUP160是IGF2BP2的下游靶标，NUP160可促进肺腺癌的转移和进展
已有研究证实，敲低NUP160可抑制细胞增殖并诱导凋亡与自噬。为进一步探究这一现象，作者检测了P62和LC3-II/I，发现敲低NUP160后，P62表达降低，而LC3-II/I比值升高（图7A），自噬体和自噬溶酶体数量增加（图7B）。自噬抑制剂3-MA可逆转敲低NUP160对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用（图7C-E）。这些发现共同表明，IGF2BP2可与NUP160结合并稳定NUP160的mRNA，敲低NUP160可诱导肺腺癌细胞发生自噬，抑制肺腺癌发生发展。
图7.敲低NUP160可促进肺腺癌细胞的自噬
6.敲低NUP160可逆转过表达IGF2BP2在促进肺腺癌转移和进展中的作用
接着，作者进一步验证NUP160与GF2BP2在肺腺癌进展中的功能。在NUP160敲低且IGF2BP2过表达的H1299和HCC827细胞中进行了细胞功能实验显示，敲低NUP160可逆转IGF2BP2过表达对肺腺癌细胞增殖、迁移、侵袭和集落形成的促进作用（图8A-E）。
图8. IGF2BP2与NUP160协同促进肺腺癌进展
7. circRAPGEF5-IGF2BP2-NUP160轴抑制肺腺癌细胞自噬
作者利用此前建立的裸鼠过表达circRAPGEF5肿瘤移植模型样本进行RT-qPCR和WB实验。结果表明，在体内过表达circRAPGEF5会导致IGF2BP2和NUP160的 mRNA水平升高（图9A）。WB显示，circRAPGEF5过表达组中P62和IGF2BP2的蛋白水平升高，而 LC3-II/I 比值降低，N-cadherin和Vimentin表达上调（图9B）。对来自温州医科大学附属第一医院的93例肺腺癌样本进行RT-qPCR显示，circRAPGEF5、IGF2BP2和NUP160的表达均上调（图9C-E），且三者之间具有表达相关性（图9F-H）。原发肿瘤模型基因工程小鼠的HE 染色也证实circRAPGEF5对肿瘤的促进作用（图9I）。
图9. 体内实验证实circRAPGEF5-IGF2BP2-NUP160通过抑制自噬促进肺腺癌的转移和进展
总结
综上所述，该研究表明，m⁶A甲基化的circRAPGEF5与IGF2BP2结合，通过IGF2BP2-NUP160信号轴抑制肺腺癌细胞的自噬，进而促进肺腺癌细胞的增殖、侵袭和迁移，最终推动肺腺癌的转移和进展。该研究结果使circRAPGEF5有望成为开发新型肺腺癌治疗干预手段的潜在靶点。
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